一、保存方法選擇與技術參數優化

1. 短期保存（-80℃）

凍存液配方?

通用型：10% DMSO + 90% FBS，需預冷至4℃并與細胞懸液等體積混合

低毒性型：5% DMSO + 2% FBS + 3%海藻糖（適用于敏感細胞）

程序降溫?

采用梯度冷凍：

4℃ → -20℃（-1℃/min）→ -80℃（過夜）→液氮

使用程序降溫盒可替代梯度操作

2. 長期保存（液氮）

氣相保存?

溫度范圍：-150℃～-190℃，需配備氧濃度監測（＜500ppm）

液相保存?

采用雙層凍存管（耐壓＞500psi），推薦CryoBox™定位系統

二、標準化操作流程

2. 凍存分裝規范

分裝體積：≤1.5mL/管（耐高壓螺紋管）

標記信息：細胞株編號+傳代次數+凍存日期+操作者

3. 復蘇關鍵步驟

快速解凍?：37℃水浴震蕩90秒（冰晶完-全消失時終止）

梯度洗滌?：

首步加入等量預熱的無血清培養基稀釋

800g離心5分鐘去除DMSO殘留

三、質量控制體系

1. 過程監控

溫度穩定性?：

-80℃冰箱每日溫差≤±2℃，液氮罐周蒸發量＜0.5L

樣本追溯?：

建立電子檔案（含凍存液批號/操作人員/設備編號）

2. 風險控制

四、特殊細胞處理策略

1. 懸浮細胞

預處理：添加5%羥乙-基淀粉防止細胞聚集

凍存密度：調整為1×10?/mL（常規細胞的2倍）

2. 原代細胞

凍存液優化：無血清配方（含15%海藻糖+5%人血白蛋白）

分裝方式：預冷凍存管+快速分裝（操作時間＜3分鐘）