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ELISA檢測(cè)試劑盒原理
    應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)水平。用純化的待測(cè)物質(zhì)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待測(cè)物質(zhì)，再與HRP標(biāo)記的待測(cè)物質(zhì)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物質(zhì)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)濃度。
    不同廠(chǎng)家的試劑盒的檢測(cè)范圍并不相同，一般說(shuō)來(lái)，診斷試劑的檢測(cè)范圍以ng/ml計(jì)。而常見(jiàn)的科研試劑盒中的樣本中的目標(biāo)蛋白，范圍可隨樣本的類(lèi)型而變化。所以實(shí)驗(yàn)前應(yīng)通過(guò)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法確定樣本是否在所購(gòu)試劑盒的范圍內(nèi)，如果不在檢測(cè)范圍內(nèi)，分兩種情況對(duì)待。
 1. 如果樣本中目標(biāo)蛋白太低，需找相應(yīng)靈敏度更高的試劑盒來(lái)檢測(cè)或濃縮樣本；
 2. 如果樣本中目標(biāo)蛋白太高，則需要進(jìn)一步稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。
    
   1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。
    組織勻漿液的樣本，要制備過(guò)程中需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，防止蛋白成份被內(nèi)源性蛋白酶降解，造成檢測(cè)結(jié)果的值偏低。因組織勻漿液的樣本蛋白種類(lèi)多，含量豐富，實(shí)驗(yàn)參照血清血漿標(biāo)本的處理方法進(jìn)行，否則就會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體是加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標(biāo)本，需稀釋時(shí)，請(qǐng)將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100ul。
    因?yàn)槟繕?biāo)蛋白不同，可能造成降解的蛋白類(lèi)型可能不一樣，如果實(shí)驗(yàn)前通過(guò)文獻(xiàn)確定用哪種蛋白酶抑制劑，有針對(duì)性加入，可節(jié)省抑制劑。如果查不到相關(guān)文獻(xiàn)，可采用組合抑制的辦法確保蛋白不易被降解。